EdU細胞增殖流式檢測試劑盒

產品描述
細胞增殖是評價細胞活性、代謝、生理和病理狀況的重要指標。EdU (5-Ethynyl-2`- deoxyuridine)是一種胸腺嘧啶核苷類似物，其連有的炔烴基團在天然化合物中很少見，能夠在細胞增殖時期代替胸腺嘧啶(T)摻入正在復制的DNA分子中，通過基于EdU與熒光染料的特異性共軛反應，把熒光基團標記到新合成的含有EdU的DNA上面，這樣可以進行高效快速的檢測出DNA復制活性，此技術廣泛應用于細胞增殖、細胞分化、生長與發(fā)育、DNA損傷修復等方面的研究。
傳統(tǒng)的免疫熒光染色(BrdU)檢測方法需要DNA變性、抗原修復、抗原抗體過夜孵育等復雜繁瑣的操作步驟。而EdU檢測方法不需要劇烈的DNA變性，只需溫和的細胞固定化和透化處理，能夠較好地保護細胞形態(tài)、DNA整體結構及細胞內抗原識別位點，操作步驟更加快速、靈敏和準確。EdU與胸腺嘧啶(T)結構非常相似，大小卻只有BrdU抗體的1/500，很容易在細胞內擴散；無需抗原抗體反應，能在細胞和組織水平更快速便捷地反映DNA復制活性。
訂購信息

產品組分

運輸與保存
常溫運輸。4℃保存，有效期12個月。
使用方法
細胞培養(yǎng)
將細胞接種于孔板中（以下溶液加入量是以6孔板為例），培養(yǎng)至正常生長階段。
藥物處理
根據實驗需要進行各種細胞處理。
EdU標記
1.設置1個不加EdU標記培養(yǎng)基的NC對照組，以便進行流式檢測數(shù)據的背景分析。
2.將細胞培養(yǎng)基與EdU溶液按照500：1的比例混合，制成2×EdU標記培養(yǎng)基。
3.提前將2×EdU標記培養(yǎng)基預熱，然后將500微升2×EdU標記培養(yǎng)基與等體積細胞培養(yǎng)基混合，獲得6孔板中每孔1ml 1×EdU溶液。
【注】：①不建議替換全部培養(yǎng)基，這樣可能會影響細胞增殖的速度；②配置好的培養(yǎng)基建議現(xiàn)用現(xiàn)配，用量以沒過細胞為宜。
4.孵育細胞2 h，棄培養(yǎng)基。
【注】：①培養(yǎng)時間取決于細胞的增殖速度和生長狀態(tài)；②大多數(shù)腫瘤細胞以及粘附細胞系均可采用2 h的孵育時間。
5.將細胞收集至流式管中，1000rpm 離心5 min，用槍頭吸棄上清。
【注】：①如貼壁細胞，請先消化收集；②離心轉速可按特定細胞培養(yǎng)經驗進行設置。
6.以1×PBS清洗細胞，1000rpm 離心5 min，用槍頭吸棄上清。
細胞的固定和通透
1.每管加入1mL 4%多聚甲醛細胞固定液固定15-30 min，1000rpm 離心5 min，棄固定液。
2.每管加入2mL 2mg/mL 甘xx，搖床孵育5 min，以中和過量的多聚甲醛。
3.1000rpm 離心5 min，棄甘xx溶液，每管加入2mL PBS洗液清洗，1000rpm 離心5 min，棄上清。
4.每管加入1mL 0.5% Triton X-100細胞通透液，室溫通透10 min，1000rpm 離心5 min，棄細胞通透溶液。
5.每管加入2mL PBS洗液，室溫清洗5 min，1000rpm 離心5 min，吸棄上清。
EDU染色
1.通過用10：1去離子水稀釋反應緩沖液，進行配制1×反應緩沖液。
2.按照溶解 200 mg緩沖添加劑溶于1 mL去離子水的比例稱取適量的粉末進行溶解，即為可用的緩沖添加劑的濃度，建議現(xiàn)用現(xiàn)配。
【注】：緩沖添加劑為白色粉末，較難準確稱量，稱量范圍可稍微放寬，但是不應超過±20%，且該粉末較易氧化，使用后請旋緊管蓋，如試劑出現(xiàn)棕黃色，則需報廢或更換。
3.按照以下的表格進行染色反應液的配制：

4.每管加入配置好的檢測混合液，體積以覆蓋細胞為宜，充分重懸細胞，避光、室溫孵育10-30 min。
5.1000rpm 離心5 min，吸棄染色反應液，每管加入2mL 0.5% Triton X-100細胞滲透液清洗2次，每次10 min；離心棄細胞滲透液，用500uL PBS重懸細胞。
DNA染色
1.將Hoechst 33342 *超級純*(李記貨號：AC12L021)用PBS溶液1:1000進行稀釋得到1×Hoechst染色液。
2.每管加入1×Hoechst染色液，以覆蓋細胞為宜，室溫避光孵育10-15 min后，棄染色液。
3.加入500 μL PBS重懸細胞。
其它染色（自備）
（可選）可以根據實驗需要進行細胞表面或細胞內抗原的抗體染色。染色完的樣品上機檢測時，根據使用的染料選擇合適的通道檢測。
流式檢測及分析
1.建議染色完成后立即進行流式檢測；如果條件限制，請于4℃條件下避光濕潤保存3 d之內完成檢測。
2.檢測細胞數(shù)量建議盡量能達到10⁷級，若細胞數(shù)量較少，檢測的細胞數(shù)量可調整為10⁶起始進行實驗。

注意事項

1. 本產品僅限于科學實驗研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領域。